抗体作为一种能特异性识别并结合特定靶标的通用蛋白，是一种理想的治疗和诊断分子，在疾病治疗，特别是在癌症治疗中发挥着重要的作用。动物免疫技术是一种传统的抗体发现方法，但耗时长、过程繁杂以及存在伦理争议和免疫反应等问题限制了它的应用。随着分子生物技术的发展，人们开发了重组抗体筛选技术用于更快速地鉴定高亲和力抗体。酵母表面展示技术作为一种真核表达系统，具有高效的翻译后修饰机制以及能更好地合成具有多个二硫键的复杂哺乳动物蛋白质等优点，被广泛应用于发现新的重组抗体。
🎈酵母表面展示技术简介
酵母表面展示技术由Boder和Wittrup于1997年首次提出，他们利用α-凝集素展示系统，把目标蛋白与Aga2p融合表达，Aga2p可与细胞壁锚定蛋白Aga1p通过二硫键连接，从而将目标蛋白展示在酵母细胞壁上（图1）。酵母表面展示的过程包括三个步骤：首先，将目标蛋白的编码基因与Aga2p的编码基因融合；然后用电穿孔或者醋酸锂转化的方法将融合基因转化到酵母细胞中；最后在选择性条件下培养并诱导转化的酵母细胞，以确保融合蛋白展示在酵母表面上。一旦目标蛋白在酵母表面展示成功后，可将融合表达的标签蛋白用荧光标记，通过流式细胞术对目标蛋白进行检测或者筛选。
图1 酵母表面展示抗体示意图[1]
🎈酵母表面展示技术发现重组抗体的流程
利用酵母表面展示技术发现新重组抗体的流程可分为三个步骤（图2）：1.构建抗体的酵母展示库，主要是通过易错PCR或者定点饱和突变的方法在抗体基因中插入大量的突变序列，将突变的抗体基因转化进酵母中，在酵母表面展示出氨基酸序列多样的重组抗体。酵母展示库的丰度对后续新抗体的发现至关重要，可通过优化分子克隆的方法和提高酵母转化效率来获得更高丰度的酵母展示库，以增加发现优秀抗体的概率。2.从抗体的酵母展示库中发现新抗体，这一步主要利用magnetic-activated cell sorting (MACS)和fluorescence-activated cell sorting (FACS)从抗体库中把能特异性结合目标抗原的突变体筛选出来。MACS对细胞的损伤小，分离速度可达10^7 细胞/秒，每次测试通量可达5×10^9，通常初始抗体库通常会先用MACS分选，用来去除不表达抗体的酵母并快速缩小阳性抗体文库的库容。FACS的灵敏度高，分离速度能到2×10^4细胞/秒，每天的测试通量可达10^8以上，经过几轮的FACS筛选，通常可获得数十种抗体突变序列。3.突变体表达与活性验证，通过筛选得到的突变抗体与目标抗原的结合实验排除假阳性突变体，确定其高特异性和高亲和性。另外可结合分子动力学实验得到突变体与目标抗原结合的KD值，进一步评估突变体的亲和力。
图2 酵母表面展示技术发现新抗体的流程图[1]
🎈酵母表面展示技术在重组抗体发现中的优势
1.酵母表面展示技术在抗体发现中的第一个优势就是它能模拟人类免疫系统中抗体选择的自然过程，，研发人员使用酵母表面展示技术可以创建大型抗体变体库，并可以针对靶抗原进行高通量筛选。
2.酵母表面展示技术的另一优势在于其与真核蛋白表达系统的兼容性，酵母细胞能够正确折叠并组装抗体这类复杂蛋白质，这一特性在筛选针对膜蛋白或构象敏感性抗原等挑战性靶点的抗体时尤为重要。
3.此外，酵母展示技术能够识别具有不同结合模式的抗体。与主要产生靶向单一表位的单克隆抗体的杂交瘤技术不同，酵母展示文库在单次实验中即可获得具有不同结合特异性的多克隆抗体群，这一特性对于开发诊断试剂盒或研究复杂生物系统（需同时检测多个靶标）具有重要价值。
🎈酵母表面展示技术发现的新抗体
人们利用酵母表面展示技术已经发现许多新抗体，部分抗体作为药物已经获批上市。信达生物研发的PD-1抗体信迪利单抗在2018年获中国药监局批准上市，该抗体是信达生物和Admiab公司应用酵母表示展示技术合作研发的全人源抗体，主要用于治疗晚期或转移性非小细胞肺癌（NSCLC）、复发或难治性经典型霍奇金淋巴瘤（cHL）以及特定类型的食管鳞状细胞癌等恶性肿瘤[2]。2023年8月获中国药监局批准上市的托莱西单抗是我国首个、全球第三款PCSK9单抗，也是应用酵母表面展示技术研发生产的，被纳入多层次血脂干预的重要管理手段之一，特别是其降低Lp(a)疗效得到了肯定[3]。除单特异性抗体外，酵母表面展示技术在双特异性抗体的研发中也有重要的应用。Tzuri N等人基于酵母表面展示技术发现一种能同时识别PDL1和VEGF的双特异性蛋白DuRan-Bis，与单特异性抗体单独或者联合治疗相比，DuRan-Bis嵌合抗体对胶质母细胞瘤的细胞增殖表现出更强的抑制作用[4]。
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关键词：#酵母表面展示 #靶药开发 #抗体库 #人源化 #CLDN6
参考文献：
[1] Mustafa M I, Alzebair A A, Mohammed A. Development of Recombinant Antibody by Yeast Surface Display Technology[J]. Current research in pharmacology and drug discovery, 2024, 6.
[2] Hoy S M. Sintilimab: First Global Approval[J]. Drugs, 2019, 79(3), 341–346.
[3] Liu H H , Li S , Li J J .Tafolecimab, a Third Monoclonal Antibody for PCSK9 as the Novel Lipid-Lowering Drug Around the World: A Narrative Review[J].Drugs, 2025, 85(5):627-642.
[4] Tzuri N, Yegodayev K M, Novoplansky O, et al.Developing a dual VEGF/PDL1 inhibitor based on high-affinity scFv heterodimers as an anti-cancer therapeutic strategy[J].Scientific Reports, 2023, 13.
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